Forensisch relevante SNP-Genotypisierung mittels elektronischer Microarray-Technologie

Die vorliegende Dissertation entstand im Rahmen eines multizentrischen EU-geförderten Projektes, das die Anwendungsmöglichkeiten von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zur Individualisierung von Personen im Kontext der Zuordnung von biologischen Tatortspuren oder auch bei der Identifizierung unbekannter Toter behandelt. Die übergeordnete Zielsetzung des Projektes bestand darin, hochauflösende Genotypisierungsmethoden zu etablieren und zu validieren, die mit hoher Genauigkeit aber geringen Aufwand SNPs im Multiplexformat simultan analysieren können. Zunächst wurden 29 Y-chromosomale und 52 autosomale SNPs unter der Anforderung ausgewählt, dass sie als Multiplex eine möglichst hohe Individualisierungschance aufweisen. Anschließend folgten die Validierungen beider Multiplex-Systeme und der SNaPshot™-Minisequenzierungsmethode in systematischen Studien unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen des Projektes. Die validierte Referenzmethode auf der Basis einer Minisequenzierung diente einerseits für die kontrollierte Zusammenarbeit unterschiedlicher Laboratorien und andererseits als Grundlage für die Entwicklung eines Assays zur SNP-Genotypisierung mittels der elektronischen Microarray-Technologie in dieser Arbeit. Der eigenständige Hauptteil dieser Dissertation beschreibt unter Verwendung der zuvor validierten autosomalen SNPs die Neuentwicklung und Validierung eines Hybridisierungsassays für die elektronische Microarray-Plattform der Firma Nanogen Dazu wurden im Vorfeld drei verschiedene Assays etabliert, die sich im Funktionsprinzip auf dem Microarray unterscheiden. Davon wurde leistungsorientiert das Capture down-Assay zur Weiterentwicklung ausgewählt. Nach zahlreichen Optimierungsmaßnahmen hinsichtlich PCR-Produktbehandlung, gerätespezifischer Abläufe und analysespezifischer Oligonukleotiddesigns stand das Capture down-Assay zur simultanen Typisierung von drei Individuen mit je 32 SNPs auf einem Microarray bereit. Anschließend wurde dieses Verfahren anhand von 40 DNA-Proben mit bekannten Genotypen für die 32 SNPs validiert und durch parallele SNaPshot™-Typisierung die Genauigkeit bestimmt. Das Ergebnis beweist nicht nur die Eignung des validierten Analyseassays und der elektronischen Microarray-Technologie für bestimmte Fragestellungen, sondern zeigt auch deren Vorteile in Bezug auf Schnelligkeit, Flexibilität und Effizienz. Die Automatisierung, welche die räumliche Anordnung der zu untersuchenden Fragmente unmittelbar vor der Analyse ermöglicht, reduziert unnötige Arbeitsschritte und damit die Fehlerhäufigkeit und Kontaminationsgefahr bei verbesserter Zeiteffizienz. Mit einer maximal erreichten Genauigkeit von 94% kann die Zuverlässigkeit der in der forensischen Genetik aktuell eingesetzten STR-Systeme jedoch noch nicht erreicht werden. Die Rolle des neuen Verfahrens wird damit nicht in einer Ablösung der etablierten Methoden, sondern in einer Ergänzung zur Lösung spezieller Probleme wie z.B. der Untersuchung stark degradierter DNA-Spuren zu finden sein.

Die Regulation der Ubiquitinligase CHIP durch das Cochaperon BAG2 im zellulären System und im Kontext der replikativen Seneszenz

Eine funktionierende Proteinqualitätskontrolle ist essenziell für die Vitalität einer Zelle. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Proteinfaltung und -degradation wird von molekularen Chaperonen aufrechterhalten, deren Aktivität wiederum durch die Interaktion mit zahlreichen Cochaperonen moduliert wird. Das Cochaperon CHIP ist ein zentraler Faktor in Proteintriage-Entscheidungsprozessen, da es als Ubiquitinligase Chaperonsubstrate dem Abbau zuführt und somit die Chaperonmaschinerie direkt mit den Systemen der Proteindegradation verbindet. Um Polypeptide vor einem vorzeitigen Abbau zu schützen, wird die destruktive Aktivität von CHIP durch weitere Cochaperone reguliert. rnIn dieser Arbeit konnte die Hemmung der Ligaseaktivität von CHIP durch das Cochaperon BAG2 mechanistisch erstmals in einem zellulären System nachgewiesen werden. Dazu wurde die humane IMR-90 Fibroblasten Zelllinie verwendet. Die Ubiquitinierungsaktivität von CHIP wurde anhand von HSP72 als Modell-CHIP-Substrat untersucht. Durch die verringerte Ubiquitinierung, und damit dem reduzierten Abbau von HSP72, regulierte BAG2 dessen intrazelluläre Proteinspiegel, ohne dabei selbst eine Hitzeschockantwort zu induzieren. Überexprimiertes BAG2 wirkte sich trotz stabilisierter HSP72-Spiegel bei einem appliziertem Hitzestresses negativ auf die Zellvitalität aus, vermutlich da BAG2 durch die Inhibition von CHIP-vermittelter Ubiquitinierung massiv in das Gleichgewicht zwischen Substratfaltung und -degradation eingreift.rnDa sich die Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle in der Alterung stark verändern und sich den wandelnden Bedingungen in der Zelle anpassen, wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit mit Hilfe des IMR-90 Zellsystems als etabliertes Modell zellulärer Seneszenz analysiert, inwieweit sich die Aktivität und die Regulation von CHIP durch BAG2 in der zellulären Alterung ändern. In seneszenten Zellen war HSP72 erheblich weniger ubiquitiniert als in jungen Fibroblasten, was auf eine reduzierte CHIP-Aktivität hinweist. Diese blieb jedoch durch BAG2 weiterhin modulierbar. Die Funktion von BAG2 als Inhibitor der Ubiquitinligase CHIP blieb demnach in seneszenten Zellen bestehen. In gealterten Fibroblasten regulierte BAG2 außerdem die Proteinspiegel des CHIP-Substrates und Seneszenzinitiators p53, was BAG2 eine mögliche Rolle in der Etablierung des Seneszenz-Phänotyps zuspricht. Weiterhin unterlagen die Proteinspiegel der beiden funktionell redundanten CHIP-Modulatoren BAG2 und HSPBP1 in der zellulären Alterung einer reziproken Regulation. In gealterten Mäusen trat die gegenläufige Veränderung der beiden Cochaperone gewebsspezifisch in der Lunge auf. Außerdem waren die BAG2-Proteinspiegel im Hippocampus gealterter Tiere signifikant erhöht.rnZusammenfassend konnte anhand der erzielten Ergebnisse die Funktion von BAG2 als Inhibitor von CHIP im zellulären System bestätigt werden. Außerdem durchlaufen die Aktivität und die Regulation von CHIP einen seneszenzspezifischen Adaptationsprozess, welcher für die Erhaltung der Proteostase in der Alterung relevant sein könnte und in welchem die Funktion von BAG2 als CHIP-Modulator möglicherweise eine wichtige Rolle spielt.rnZukünftige Studien könnten die komplexen Mechanismen weiterführend aufklären, mit denen CHIP-Aktivität reguliert wird. Dies kann helfen, der altersbedingten Abnahme an proteostatischer Kontrolle entgegenzuwirken und aberrante Proteinaggregation in altersassoziierten Erkrankungen vorzubeugen.rn